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双重PCR-毛细管电泳法检测大豆转基因
栏目:企业动态 发布时间:2019-09-20 06:09
实验方法原理针对转基因大豆基因组中被导入的35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS抗草甘膦基因等外源基因,自行设计了两对引物,采用双重PCR同时扩增上述基因,用8g/L羟丙基甲基纤维素为...

  实验方法原理针对转基因大豆基因组中被导入的35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS抗草甘膦基因等外源基因,自行设计了两对引物,采用双重PCR同时扩增上述基因,用8g/L羟丙基甲基纤维素为筛分介质,在50cm×100m i.d.涂壁毛细管中,于一10kV电压下用激光诱导荧光-毛细管电泳检测转基因大豆的PCR扩增产物。

  实验材料阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质进口转基因大豆样品非转基因大豆寡核苷酸引物

  仪器、耗材毛细管电泳-激光诱导荧光检测装置石英毛细管UNO 型PCR仪PAC3000型电泳仪UVI紫外成像分析仪

  2.随着纤维素质量浓度的增加,对DNA段的分离能力越好,当胶质量浓度达到8g/L时,110/147bpDNA段的分离度最大(R=2.91)。继续增加胶的质量浓度,分离度变化不大,但筛分介质的粘度增大,分析时间延长。故本实验选用HPMC为8g/L.

  3.不同大小的DNA标准片段的迁移时间均随场强的升高而减小。对于147bp DNA段,柱效的考察结果显示,在场强为150V/cm200V/cm 时具有高理论塔板数2.3×1O0000.当电场强度高于200V/cm时,迁移时间变短,但焦耳热效应也较为显著,从而引起谱带的展宽,在一定程度上降低了柱效,使分离度降低。为了进行快速分离,我们选用在较高的场强200V/cm下进行电泳分析。

  DNA段迁移时间的重现性是基因分析中的重要指标之一。我们对DAN片段迁移时间的重现性进行了考察,在优化的实验条件下,对所用的DNA相对分子质量marker和PCR产物连续分析6次,并在待测试样中加入Sulforhdamine B荧光试剂作为内标物,采用相对迁移时间以消除进样时间和电压的波动对迁移时间的影响。在优化的实验条

  将阳性抗草甘膦转基因大豆标准、空白对照和进口大豆的双重PCR产物以及阴性非转基因大豆的内源基因PCR产物同时用毛细管电泳和琼脂糖凝胶电泳进行了比较实验,传统的琼脂糖凝胶电泳结果可见,进口大豆和阳性对照的转基因大豆标准均扩增出2个条带,分别为125 bp和142 bp;作为阴性对照的非转基因大豆仅能扩增出内源基因的118 bp条带;用无菌水作模板的空白对照不能扩增出任何条带。比较琼脂糖凝胶电泳与毛细管电泳的结果,两者基本一致。

  毛细管电泳采用上万伏的高电压,能更有效地分离差异较小的片段。并能在较短的时间内完成分析。本实验目标DNA段在15 min内就可被分离,缩短了分析时问。而琼脂糖凝胶电泳分离上述两个片段需要50min.可见,同琼脂糖凝胶电泳相比,毛细管电泳分析速度更快 毛细管电泳所需的样品量少。本实验采用电动进样,进样量约5nl,而琼脂糖凝胶电泳需要510l的上样量 所以用毛细管进行分析,可以大大节约样品用量,适合于痕量分析。

  凝胶电泳图谱的条带一般较宽,不利于DNA段大小的确定。而毛细管电泳柱效高。峰形尖锐,鉴定能力强。本实验采用内标与样品同时电泳,可减少进样时间和电压的波动等造成的实验误差,提高了结果的准确性。根据DNA Marker和样品毛细管电泳图谱,可得DNA段大小分别为124 bp和145 bp,与测序结果相比较。分别差1 bp和3 hp;图中峰的DNA段大小为121bp,与文献报道的片段大小相比仅差3 bp.由此可见。用毛细管电泳比用凝胶电泳确定DNA段大小更为准确。

  综上所述,本研究利用双重PCR技术同时扩增抗草甘瞵转基因大豆的3种外澡靶基因,只需一次PCR反应就可以准确鉴定出抗草甘膦大豆 采用激光诱导荧光-毛细管电泳分析PCR产物,较传统琼脂糖凝胶电罚:相比,缩短了分析时间,分析灵敏度显著提高,而且样品用量少 本研究所建立的方法为食品中转基因成分的快速检测提供了一个可靠的分析手段。

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